电化学聚合吡咯掺杂蛋白A固定抗体的安培型沙门氏菌微传感器
【摘要】 基于电化学聚合将蛋白A(staphylococcal protein A)与吡咯掺杂后共聚于电极表面的新方法设计传感界面，结合采用微机电系统（micro electro mechanical systems, MEMS)技术制备的两电极系统，开发了一种新型的利用电聚合引入蛋白A进而固定抗体、提高检测性能的安培型免疫微传感器，并应用于沙门氏菌（Salmonella typhimurium, S.typhi）的检测。考察了传感器检测沙门氏菌的响应特性，优化了相关实验条件及参数，并结合扫描电镜(scanning electron microscopy，SEM)图像验证了该抗体固定方法的有效性。实验表明，采用电化学聚合方法固定蛋白A进行敏感膜修饰，操作简便省时(<10 min)、可控性强，试剂用量少(10 μL),能够有效改善抗体固定效果，提高传感器检测性能，适于微型免疫传感器的表面修饰研究。以此设计的安培型免疫微传感器能够检测100 cfu/mL沙门氏菌溶液，具有良好的重复性和特异性。
【关键词】 电化学聚合 蛋白A 微机电系统 安培型免疫微传感器 沙门氏菌
1 引言
采用微机电系统(micro electro mechanical systems, MEMS)技术制备的安培型免疫微传感器，应用于免疫生物分析领域进行蛋白质及微生物检测时，有效地固定抗原、抗体等大分子蛋白质是至关重要的步骤。目前,常用的固定方法如物理吸附、共价结合以及凝胶包埋等[1,2]，存在难以控制膜厚及固化区域、繁琐耗时等不足。能够简单有效地实现抗原抗体的固定可显著提高传感器性能[3，4]。因此,固定方法是免疫传感器性能研究的热点内容之一，其中利用电活性聚合物薄膜改善电极表面修饰效果的研究[5～7]更是受到极大的关注。
蛋白A(staphylococcal protein A)能够非特异性地与抗体的Fc段结合，使抗体的抗原结合位点Fab段得到充分的暴露，因而常被用于构建免疫传感界面，实现抗体的定向固定。然而对于蛋白A的引入，文献报道的方法，如共价结合、自组装法[8]等，一般操作较为繁琐，并且在对微尺度表面进行修饰时较为不便。本实验采用电聚合吡咯时掺杂蛋白A的方法，利用聚合物的导电性[9]和对蛋白质的吸附作用[5,10]，以及蛋白A对抗体的定向固定作用[11]，实现安培型免疫微传感器的敏感电极表面修饰，省时、操作简便、可控性强，能够有效提高微尺度敏感电极表面的抗体固定效果，改善传感器性能。
目前，国际上利用阻抗式、电流式等电化学免疫传感器检测细菌并应用于食品安全领域正处于研究的热点[12,13]。本实验所设计的沙门氏菌微传感器，能够在2 h内实现对沙门氏菌的快速、简便、定量检测。相比于目前国内实验室检测致病菌的标准检测法检测周期长（5～7 d）、检测步骤较多、配套试剂复杂、不利于对食品安全程度的及时掌握等不足[14,15]，本传感器具有低成本、操作简单易控，便于微型化、快速检测等优点，在食品安全监测领域具有广阔的应用前景。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
RST电化学工作站（苏州瑞思特仪器有限公司）；兔多克隆沙门氏菌抗体（rabbit polyclonal to salmonella capture antibody）、辣根过氧化物酶（HRP）标记鼠单克隆沙门氏菌抗体（mouse monoclonal to salmonella detection antibody²HRP)(美国Abcom公司）；蛋白A（staphylococcal protein A）、牛血清蛋白（BSA）、磷酸盐缓冲液（PBS）药片（0.01 mol/L，pH 7.4, Sigma公司）；吡咯、Na2HPO4、NaH2PO4、H2SO4、Na2SO4、H2O2等（北京化学试剂公司），其它试剂均为分析纯；实验所用水为去离子水，检测所用标准沙门氏菌（鼠伤寒沙门氏菌）溶液由微生物所细菌保藏管理中心培养并采用细菌计数法标定其浓度。
2.2 微型电极的制备
采用标准MEMS工艺，在硅基底上制备了含有微反应池的微电极型安培免疫传感芯片（图1）。微电极为对称式“圆²环形”结构，在增大对电极面积的同时，有效地提高了工作电极与对电极之间电场空间分布的对称性，改善传感器的响应性能。利用SU²8胶在硅片表面电极周围制作微型反应池，用于将反应溶液限定于工作电极和对电极所在的检测区域。芯片中心工作电极的面积为1 mm2，将作为敏感电极实现抗原、抗体的固定和检测，试剂用量仅为1～10 μL。
图1 微型两电极芯片结构示意图（略）
Fig.1 Schematic structure of amperometric transducer
A. 俯视图(top view); B. 剖面图(cross section view); C. 实物照片(photograph of amperometric transducer)。1. 工作电极(working electrode); 2. 对电极(counter electrode); 3. SU²8 微型反应池(SU²8 micro reaction pool); 4. SU²8绝缘层(insulating layer)。
2.3 微型电极表面敏感膜的制备
利用聚吡咯作为“分子导线”使电子在生物活性物质与电极间直接传递。将蛋白A与0.1 mol/L吡咯溶液掺杂，用循环伏安法在电极表面进行电聚合后完成蛋白A的固定，扫描范围0～0.8 V,扫描速率50 mV/s。
滴加1 μL 450 mg/L沙门氏菌捕获抗体（capture antibody）溶液于工作电极表面温育2 h，再用PBS清洗、干燥。滴加2 μL 1% BSA于电极表面温育1 h，用于封闭电极表面的非特异性活性位点，减少非特异性反应，经PBS清洗，干燥备用。
2.4 沙门氏菌测试方法
采用夹心式酶联免疫分析法[16]进行测定（图2）。在微反应池中滴加一定浓度的沙门氏菌待测液温育30 min，通过捕获抗体的特异性识别完成沙门氏菌在敏感膜上的固定；在微反应池中再滴加1 μL沙门氏菌酶标抗体(detection antibody²HRP)溶液（150 mg/L)覆于敏感膜上30 min，对已固定的待测抗原进行特异性标定，形成“固相抗体²待测抗原²酶标抗体”夹心复合物，再用PBS清洗、干燥。向微型反应池中加入H2O2底物溶液（0.01 mol/L PBS, pH 7.4），取0.3 V为工作电压，采用计时电流法记录产生的催化电流。整个检测过程从电极表面敏感膜制备完毕后开始，到得到反应电流为止，所需时间少于2 h。除特殊说明外，所有实验均在4 ℃进行。
图2 沙门氏菌检测原理图［１６］（略）
Fig.2 Principle of detection of Salmonella typhimurium［１６］
3 结果与讨论
3.1 电化学聚合法在微尺度表面引入蛋白A的可行性研究
蛋白A在免疫学中广泛应用，常用于各种抗体的提取和纯化。通过蛋白A结合抗体，使被固定抗体的抗原结合位点趋向一致，并较好地保持其空间构象，有助于提高固相抗体的结合率，改善免疫检测效果。本实验利用蛋白A两性解离的特性，通过调整聚合溶液的pH值，使蛋白A作为平衡离子掺入聚吡咯膜内，实现蛋白A的固定。本方法操作简便、能够严格控制固定的敏感区域。聚吡咯薄膜呈松散结构，生物分子在膜内具有比较自由的微环境，能更好地保持生物分子的活性。
实验所用蛋白A的等电点为5.1。在pH 6.0的PBS溶液中，蛋白A分子呈负电性。在电极表面聚合吡咯的过程中，由于蛋白A与聚合物骨架上的正电荷间的静电吸引，从而掺入聚合膜中实现固定。利用扫描电镜(SEM)对单独聚合吡咯的聚合膜表面形貌（图3a）与掺杂不同浓度的蛋白A的聚合膜表面形貌（图3b和图3c）进行成像。对比图3a和图3b发现：掺杂蛋白A得到的聚合膜较纯聚吡咯膜在表面形貌上有显著差别，掺杂蛋白A的聚合膜颗粒相对较大，有一些颗粒聚集而形成的絮状结构,分析原因可能是蛋白在聚合膜结构中团聚所引起；对比图3b和3c发现，随着掺杂的蛋白A浓度的升高，蛋白A掺杂量的增多使得絮状结构增多，进一步证明了絮状结构的出现是由于蛋白A的掺杂所引起。
图3 工作电极表面聚合膜形貌的SEM图片 （× 5K）（略）
Fig.3 Scanning electron microscopy(SEM) images of co²electropolymer on surface of working electrode
a． 聚吡咯修饰的电极表面形貌（SEM image of surface topology of electrode coated with polypyrrole); b． 掺杂蛋白A(0.25 g/L)后的的电极表面形貌（SEM image at different magnifications of surface topology of electrode coated with co²electropolymer of staphylococcal protein A(SPA, 0.25 g/L) and polypyrrole)； c． 共聚吡咯和蛋白A(0.5 g/L)后的电极表面形貌（SEM image at different magnifications of surface topology of electrode coated with co²electropolymer of SPA(0.5 g/L) and polypyrrole)。
3.2 蛋白A的掺杂对传感器性能的影响
比较掺杂蛋白A得到的微传感器以及纯聚吡咯膜修饰的微传感器的性能，将两种传感器对1.0 × 104cfu/mL的沙门氏菌进行检测，保持所用捕获抗体的用量及温育时间不变，经电化学掺杂蛋白A继而实现抗体固定得到的传感器的响应为3.26 μΑ，是不掺杂蛋白A得到的传感器响应的1.65倍，验证了掺杂蛋白A对微传感界面进行修饰，能够有效地实现沙门氏菌抗体在微尺度表面的固定，提高沙门氏菌抗体的特异性和利用率。
3.3 沙门氏菌样品滴加量对传感器性能的影响
分别选取1、5和10 μL（本实验所设计微传感器反应池最大容量为10 μL）为沙门氏菌样品滴加量，比较传感器的检测曲线（图４）。实验表明，随着待测菌液滴加量的增多，传感器响应电流变大，有助于提高传感器的灵敏度，降低其检出限，同时也证实了此安培型免疫传感器沙门氏菌检测的有效性。
3.4 底物溶液浓度对传感器性能的影响
分别取浓度为0.03%、0.09%和0.15%的H2O2底物溶液对1.0 × 102～1.0 × 105 cfu/mL的沙门氏菌进行检测（图５）。结果表明，在适当范围内（H2O2浓度过高，反应电流过大，易出现敏感膜脱落现象，选择0.15% H2O2为最优，已能满足实验需要）提高H2O2底物的浓度可以有效提高传感器的响应电流值，实现对电流信号的放大作用，有助于此安培型免疫传感器对微量沙门氏菌的检测。
图４ 沙门氏菌样品滴加量对传感器性能影响（略）
Fig.４ Effect of usage of Salmonella typhimurium analyte on the current response of immunosensor
H2O2浓度(concentration)： 0.09%。
图５ H2O2底物溶液浓度对传感器响应电流的影响（略）
Fig.５ Effect of concentration of H2O2 on the current response of immunosensor
沙门氏菌滴加量（usage of Ｓalmonella typhimurium analyte）： 10 μL。
3.5 沙门氏菌微传感器的电流响应和重复性
对0～1.0 ×105 cfu/mL标准沙门氏菌进行检测，传感器电流响应特性曲线见图６。待测菌液滴加量为10 μL，检测所用H2O2底物溶液10 μL，浓度为0.15%。当未滴加沙门氏菌待测液，直接在敏感膜表面温育标记抗体（1 μL，150 mg/L）并滴加H2O2底物进行检测时所得电流信号为2.56 μA，即测量浓度为0 cfu/ml沙门氏菌待测液所对应的电流信号。如反应原理中所述，此电流信号是H2O2底物溶液在一定电压下所产生的固有电流，与是否滴加沙门氏菌待测液无关，因此作为传感器的基准电流，当加入沙门氏菌后由于相应的酶标抗体的引入使得传感器响应电流增大。整个检测系统电流信号分辨率最小可达到0.1 nA,相比于约为2.56 μA的基准电流，测量浓度为100 cfu/mL沙门氏菌溶液所得电流信号为2.8 μA, 200 nA的电流信号值差距较为明显，可以认为该传感器能够检出100 cfu/mL沙门氏菌溶液。
图６ 电流响应与沙门氏菌浓度校准曲线（略）
Fig.６ Current response as a function of Salmonella typhimurium concentration
10 μL沙门氏菌（Ｓalmonella typhimurium）； 底物溶液（enzyme substrate）: 10 μL 0.15% H2O2。
用5支传感器对相同浓度的沙门氏菌溶液进行检测，测量背景电流响应值为（2.56±0.14） μA，相对标准偏差约为9.57%；测量1.0×104 cfu/mL的电流响应值为（3.34±0.09） μA，相对标准偏差约为6.01%，重复性较好。
3.６ 非特异性免疫反应的研究
测定1.64×107 cfu/mL大肠杆菌溶液，最大响应电流值约为2.68 μA, 低于检测100 cfu/mL沙门氏菌待测液所得的响应电流值（2.8 μA）, 可见没有发生明显的非特异性免疫反应。
【参考文献】
1 Corry B, Uilk J, Crawley C. Anal. Chim. Acta, 2003, 496(1²2): 103～116
2 Akram M, Stuart M C, Wong D K Y. Anal. Chim. Acta, 2004, 504(2): 243～251
3 Serge C, Carmen M, Christine M, Bruno G, Arielle L. Materials Science and Engineering C, 2006, 26: 436～441
4 Li Ting(李 庭), Zeng Guang²Ming(曾光明), Tang Lin(汤 琳), Gao Hui(高 慧), Li Jian²Bing(李建兵). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2008, 36(1): 122～126
5 Zhang X, Bai R B, Tong Y W. Separation and Purification Technology, 2006, 52:161～169
6 Ludivine G, Boutheina C, Emilie M, Andr R, Yves L, Patrice N M, Marie B V, Thierry L. Analytical Biochemistry, 2005, 347: 193～200
7 James H J, Fern M K, John M, Thomas B, David F. Current Applied Physic, 2006, 6: 587～590
8 Meng Yan²Li(孟艳丽), Wang Zhan²Hui(王战会), Jin Gang(靳 刚). Chinese Journal of Biotechnology(生物工程学报)， 2004，20(1): 111～114
9 Ramanaviius Ａ, Ramanaviien A, Malinauskas A. Electrochimica Acta, 2006, 51: 6025～6037
10 Li Y L, Neoh K G, Kang E T. Journal of Colloid and Interface Science, 2004, 275: 488～495
11 Wang H, Liu Y, Yang Y, Deng T, Shen G, Yu R. Analytical Biochemistry， 2004, 324: 219～226
12 Luigi C, Elisabetta M, Mauro T. Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2008, 48: 278～287
13 Vanessa E. G, Susana C, Mar A P, Jos M P. Talanta， 2008, 77: 876～881
14 Li Guang²Wei(李光伟), Qiu Yang(邱 杨), Xiao Xing²Long(肖性龙), Zhan Shao²Tong(詹少彤), Lan Min(兰敏), Huang Wei(黄 伟). Microbiology(微生物学通报), 2007, 34(3): 496～499
15 Zhong Wei²Jun(钟伟军)， Zhao Ming²Qiu(赵明秋)， Deng Zhong²Ping(邓中平)， Chen Jin²Ding(陈金顸)， Xu Yan²Fang(徐艳芳). Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine(中国预防兽医学报), 2008, 30(3): 220～224
16 Wu Ｘ Ｑ, Meng Ｘ Ｙ, Wang Ｚ Ｓ, Zhang Ｚ Ｒ. Bioelectrochem. Bioenerg, 1999, 48(1): 227～231
订阅登记：
请您在下面输入常用的Email地址、职业以便我们定期通过邮箱发送给您最新的相关医学信息，感谢您浏览首席医学网！